在體外分離純化VX2腫瘤細胞，觀察其生物學特性. 方法：采用組織塊法和消化法結合對兔VX2腫瘤進行原代培養,體外傳代觀察,傳代40次并對培養細胞進行形態 學觀察、細胞周期檢查、核型分析、兔及裸鼠移植. 結果：純化的兔VX2腫瘤細胞形態一致，呈圓形、多角形的上皮細胞,體積小,核漿比倒置,體外連續培養8 mo,傳代50次以上,細胞倍增時間為26.4 h,細胞周期測定G1期為74.61%, G2期為7.78%, S期為17.6%. 染色體為亞三倍體核型,眾數為60條. 高細胞濃度可保證同種移植成瘤率,裸鼠移植可成瘤, 無支原體污染. 結論：兔VX2腫瘤細胞系來源于Shope病毒致乳頭瘤惡變形成的鱗狀上皮細胞惡性腫瘤,目前已經純化，可應用于進一步腫瘤實驗研究.
【關鍵詞】 兔; 腫瘤細胞,培養的; 腫瘤標記,生物學 0引言 兔VX2腫瘤是來源于Shope病毒致乳頭瘤惡變形成的上皮細胞惡性腫瘤，屬于鱗狀細胞癌，1940年建株［1］，國內文獻對其來源描述不統一. 其特點可接種在兔體內，具有較高的肺、肝轉移特性，在大型動物模型的研究上具有很高的應用價值. 上一直沒有建成受到*并廣泛使用的VX2細胞系，多數仍以組織塊方法保存. 為進一步進行離體研究，我們分離并純化了VX2瘤株，并進行了生物學特性觀察.
1材料和方法
1.1材料新西蘭大白兔9只和BALB/c裸鼠均購自第四軍醫大學實驗動物中心；原代培養所用腫瘤組織來源于本院液氮保存冰凍組織塊，于新西蘭大白兔腿部肌肉內接種并增殖. 胎牛血清（FBS, Gibco）；培養瓶（Costar）；RPMI 1640（Gibco）；24孔板（Nunc, Roskilde, Denmark）；廣譜抗細胞角蛋白（PCK）混合型鼠抗兔mAb（Boster），廣譜抗細胞波形蛋白鼠抗豬mAb（福州邁新公司）；秋水仙素（西安山川公司）離心機（LD52A，北京醫用離心機廠）；其他試劑及儀器取自唐都醫院中心實驗室. 1.2方法 1.2.1腫瘤細胞的分離純化無菌摘取VX2腫瘤邊緣增殖活躍部分,用PBS液沖洗3次,在顯微鏡下剔除多余組織，剪成直徑0.5～1.0 mm左右的小塊,以2.5 g/L胰酶加1 g/L膠原酶于37℃消化20 min，200目尼龍網過濾后800 r/min離心5 min，取沉淀物培養，較低密度接種于6孔板. 組織塊貼壁接種于預先涂抹薄層FBS的培養瓶（Costar）瓶底，瓶底朝上，向瓶內加入含100 mL/L FBS和青鏈霉素雙 抗的RPMI 1640培養液5 mL，置37℃，50 mL/L CO2，飽和濕度的培養箱內, 2 h后緩慢將培養瓶翻轉. 消化法第2日即見細胞生長. 組織塊法于第3日組織塊均浮起，可見細胞生長. 于島狀生長的細胞處在倒置顯微鏡下無菌刮取，培養，取得多瓶純化細胞，其形態、生長速度基本一致. 待細胞成片生長、占據大部分瓶底時即用2.5 g/L胰蛋白酶于37℃下消化傳代.
1.2.2形態學觀察分別取純化后第10代和50代的細胞進行細胞爬片、HE染色、倒置顯微鏡鏡下觀察. 將VX2瘤接種于兔腿部肌肉，待成瘤后切片光鏡下觀察. 1.2.3生長特性測定將第50代細胞以1×107/L的密度接種于24孔板，每孔加入含100 mL/L FBS的1640培養基0.5 mL，置細胞培養箱中培養. 每日同一時間用胰蛋白酶消化3孔細胞，血球計數板進行計數，連續進行4 d，繪制細胞生長曲線. 利用SPSS軟件指數函數擬合模型（Exponential）輔助計算細胞群體倍增時間［2］. 制作細胞爬片，分別于貼壁后24，48，72 h計算分裂指數. 1.2.4瓊脂集落形成率測定收集第52代細胞和相應的對照細胞，制備含細胞的3.5 g/L瓊脂糖液，并加到7 g/L瓊脂糖凝膠上，于37℃，50 mL/L CO2、飽和濕度條件下培養. 3 wk后計算集落形成率.
1.2.5免疫細胞化學分析取第55代細胞爬片，室溫下用1∶1混合的甲醇與丙酮將生長在蓋玻片上的細胞固定15～20 min，分別應用PCK混合型鼠抗兔mAb及超敏加廣譜抗細胞波形蛋白鼠抗豬mAb行免疫組織化學染色，elisa試劑盒光學顯微鏡下觀察.
1.2.6染色體分析取處于80%匯合時的第60代細胞加入終濃度為0.3 mg/L的秋水仙素，在37℃，50 mL/L CO2、飽和濕度的培養箱中孵育5 h, 然后盡量吹打使阻斷于分裂中期的細胞脫壁，將細胞懸液裝入10 mL離心管. 1100 r/min離心10 min，去上清液，再向離心管中輕輕加入6 mL低滲鹽溶液75 mmol/L KCl，37℃靜置30 min. 然后加入2 mL新鮮固定液（甲醇∶冰乙酸=3∶1）預固定，用移液管吹打調勻. 1100 r/min離心10 min，去上清液. 之后加入新鮮固定液8 mL，輕輕吹打均勻，離心10 min；本步驟再重復2遍. 末次離心后，小心吸除大部分上清液，余下0.5～1.0 mL固定液，輕輕吹打調勻. 吸少量細胞懸液，滴落在-20℃預冷過的潔凈載玻片上,迅速在酒精燈火焰上烤干. 制備好的玻片立即用Giemsa染色. 顯微鏡下觀察染色后的標本，統計其染色體數目. 1.2.7細胞周期測定用2.5 g/L胰蛋白酶加0.25 g/L EDTA消化培養細胞，確保細胞盡可能打散，PRM 1640重懸后移至1.5 mL離心管中， PBS離心清洗3遍后，加入DPBS（Dulbeccos phosphate buffered saline）配制的750 mL/L冰乙醇，4℃固定2 h或過夜，PBS再離心清洗1遍后用1 g/L RNase 37℃消化20～30 min，DPBS離心清洗2遍，300目尼龍網過濾，0.2～0.3 mL DPBS重懸，PI染色5 min后流式細胞儀測定細胞周期.
1.2.8同種異體移植取第60～70代的對數生長期細胞，將新西蘭兔分為3組，每組3只，分別以1×109，1×1010，1×1011個/L的細胞懸液4 mL接種于兔腿部肌肉，觀察腫瘤在肌肉內的生長情況.
1.2.9裸鼠移植取第60～70代對數生長期細胞2×1011個/L,接種于3只BALB/c裸鼠腋窩皮下, 每只1 mL，觀察腫瘤在肌肉內的生長情況.
1.2.10支原體及致高鈣血癥能力檢測采用地依紅染色及肉湯培養法檢測培養液及細胞內支原體. 對成功接種VX2瘤的兔子進行耳緣靜脈采血，檢測血清鈣離子濃度［3-4］.
1.2.11細胞系的維持、凍存與復蘇取對數生長期細胞，用DHanks液漂洗3遍，2.5 g/L胰蛋白酶加0.2 g/L EDTA消化細胞5 min，收集細胞， 800 r/min離心5 min，用1640培養液重懸細胞，每瓶細胞分種3～5瓶，同時凍存適量細胞，凍存液為培養液中加入100 mL/L血清及80 g/L二甲基亞砜，放入液氮罐中保存. 將盛有VX2細胞的冷凍管（已冷凍保存1 mo）從液氮中取出，37℃水浴，使細胞迅速融化，將細胞懸液移入預溫至37℃、含有100 mL/L血清的1640培養液中，置于37℃，50 mL/L CO2及飽和濕度的培養箱中培養，細胞的成活率大于80%. 2結果 2.1細胞形態zui初純化的細胞部分在相差顯微鏡下可見扇形細胞質（fanlike membranes）
經過一段時間傳代，細胞呈上皮樣細胞排列, 單層貼壁生長,有鋪路石征，生長成團后即出現重疊生長現象，細胞以多邊形為. HE染色見細胞輕度嗜堿,核大,核質比例異常, 細胞呈異型性明顯，可見較多核分裂象
2.2生長特性細胞生長于第3日達到高峰. 細胞倍增時間為26.4 h. 第55代細胞的生長曲線見圖4，細胞分裂指數分別為：24 h，1.9%；48 h，7.0%；72 h，9.3%. 雙層瓊脂形成率為22.1%. 圖1倒置顯微鏡下兔VX2腫瘤細胞呈扇形細胞質×400（略） 圖2傳代后倒置顯微鏡下兔VX2腫瘤細胞呈多邊形為主×100（略） 圖3兔VX2腫瘤細胞形態 ×100（略）
2.3免疫組織化學染色細胞胞質中可見到PCK免疫組織化學染色弱陽性，波紋蛋白染色陰性.
2.4染色體分析在100個分裂中期細胞中，染色體數目主要分布于57～62之間，染色體眾數為60，多為亞三倍體. 染色體有缺失、斷裂、易位等結構異常.
2.5細胞周期分析流式細胞儀分析 結果顯示G0/G1：74.61%； G2/M：7.78%； S：17.6%； G2/G1：1.87；DI：2.40. 圖4第55代細胞的生長曲線（略）
2.6同種異體移植及裸鼠移植以1×109個/L細胞密度接種的3只兔子均未成瘤；以1×1010個/L接種的有2只成瘤，其中1只于3 wk后停止生長，解剖后可見瘤體基本為豆渣樣壞死；以1×1011個/接種的有2只成瘤. 3只成功成瘤的兔子成瘤潛伏期約10 d，分別于36，38，45 d后衰竭死亡. 解剖后可見瘤體無包膜，呈侵潤性生長，中心豆渣樣壞死，多有大量膿血，廣泛轉移，與傳統組織塊接種法成瘤特點一致. 3只裸鼠均成瘤
兔VX2細胞裸鼠移植，可見后肢皮下有成瘤現象（略） 2.7支原體及致高鈣血癥能力檢測支原體檢測陰性. 動物在接種后1 wk化驗血鈣波動在2.1～2.5 mmol/L之間. 3討論 兔VX2腫瘤是世界上廣泛使用、可在大型動物體內生長的惡性腫瘤，常用于惡性腫瘤介入和射頻治療的研究［
3-5］及影像學研究和動物模型的建立
［6-7］，其*性是小型實驗動物腫瘤模型所*的. 國內經常采用部位命名法來命名VX2腫瘤，如兔VX2肝癌，卻忽視了VX2瘤是乳頭瘤惡變而成的上皮來源的惡性腫瘤. 國外對于體外VX2細胞系的建立一直有爭議，Osato等zui早與1967年體外培養的VX2細胞由于培養箱故障而丟失
［8］，Voelkel等
［9］建立了一株VX2細胞系，活力成瘤能力低，并且喪失了產生PGE2的能力，沒有受到*. 1982年Easty等
［10］建立了VX2細胞系，與此同時瑞士的Rolf等也建立了該細胞株，并與之有差異，而比較結果沒有報道，細胞系也沒有廣泛應用. 1985年Georges等［11］發現了2種不同的VX2瘤株，一種VX2R高表達角蛋白，僅能在裸鼠體內成瘤，另一種VX2R低表達角蛋白，成瘤能力強. Dabbous等［
12］1980年也曾發現3種形態不同的VX2細胞. 劉險峰等
［13］純化了一株高表達角蛋白，高成瘤能力的VX2瘤株. 本實驗純化的VX2瘤株形態學上與文獻［8,10,11］的報道結果相似，致高鈣血癥能力檢測，與Doppelt等［14-15］的結果相同，從角蛋白表達低、接種后兔存活期短來看，惡性程度比較高，但是成瘤能力較國內一些研究較弱. 我們還發現接種后有個別腫瘤自發性衰退的現象，與Osato等報道的VX7瘤自發性衰退相似. 結合本實驗和國外的文獻報道，考慮VX2自身可能發生一定程度的分化，這可能與VX2瘤在國內外多以冰凍組織塊法保存有關，發生自發性衰退和惡性程度減低的細胞必然在傳代的過程中淘汰，因此懷疑VX2的惡性程度略有增高的可能性大，但是VX2腫瘤的基本性質沒有變化，仍然是一株具有很高實用價值的應用與大型實驗動物的腫瘤細胞. 1988年VX2瘤株從日本傳入我校以來，一直主要以液氮冷凍組織塊和動物體內傳代結合的方法保存，為進行進一步體外研究，我們純化了該細胞系，經過長時間傳代，性質穩定，可用于體外實驗. 實驗中發現的低細胞數量下成瘤能力下降和自發性消退現象，其原因尚需進一步研究.
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