摘要：蛋白質(zhì)是生物體的重要組成部分，在現(xiàn)代生物制藥領(lǐng)域有著重要的作用，本文介紹了現(xiàn)代生物分離技術(shù)反膠束萃取、雙水相萃取和電泳在多肽蛋白質(zhì)分離中的應用和現(xiàn)狀。
關(guān)鍵詞：蛋白質(zhì) 反膠束萃取 雙水相萃取 電泳
一、前言
隨著基因工程和細胞工程的發(fā)展，盡管傳統(tǒng)的分離方法（如溶劑萃取技術(shù)）已在抗生素等物質(zhì)的生產(chǎn)中廣泛應用，并顯示出優(yōu)良的分離性能，但它難以提取和分離蛋白質(zhì)。其主要原因有兩個：
被分離對象—蛋白質(zhì)等在40~500C便不穩(wěn)定，開始變性，而且絕大多數(shù)蛋白質(zhì)都不溶于有機溶劑，若使蛋白質(zhì)與有機溶劑接觸，也會引起蛋白質(zhì)的變性；
萃取劑問題—蛋白質(zhì)分子表面帶有許多電荷，普通的離子締合型萃取劑很難奏效。
新興的生物分離技術(shù)反膠束萃取、雙水相萃取和電泳在蛋白質(zhì)的分離純化方面顯示出了自身的優(yōu)勢，并展現(xiàn)出了廣闊的前景。
二、反膠束萃取
2.1 反膠束萃取技術(shù)及其萃取蛋白質(zhì)的機理
2.1.1 反膠束及其萃取原理
反膠束（reversed micelle）是雙親物質(zhì)在非極性有機溶劑中自發(fā)聚集體，又稱為反膠團、逆膠束（inverse micelle）。雙親物質(zhì)的這種膠團化過程的自由能變化主要來源于雙親分子之間偶極子－偶極子相互作用，除此之外，平動能和轉(zhuǎn)動能的丟失以及氫鍵或金屬配位鍵的形成等都可能參與這種膠團化過程。
在反膠束內(nèi)部，雙親分子極性頭基相互聚集形成一個“極性核”，可以增溶水、蛋白質(zhì)等極性物質(zhì)，增溶了大量水的反膠束體系即為微乳液（microemulsion）。水在反膠束中以兩種形式存在：自由水（free water）和結(jié)合水（bound water），后者由于受到雙親分子極性頭基的束縛，具有與主體水（普通水）不同的物化性質(zhì)，如粘度增大，介電常數(shù)減小，氫鍵形成的空間網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)遭到破壞等。
對于增溶了物質(zhì)（如水，蛋白質(zhì)等）的反膠束基本上都認為是單層雙親分子聚集的近似球體，并忽視膠束之間的相互作用。事實上，反膠束體系處于不停的運動狀態(tài)，反膠束之間的碰撞頻率為109~1011次/s，而且反膠束中的增溶物在頻繁的交換。
2.1.2反膠束萃取蛋白質(zhì)的機理
蛋白質(zhì)溶解于小水池中（正萃，或稱萃取），其周圍有一層水膜及表面活性劑極性頭的保護，使其避免與有機溶劑接觸而失活。改變pH、鹽濃度等條件蛋白質(zhì)又可回到水相（反萃），實現(xiàn)了蛋白質(zhì)的萃取分離、純化目的。反膠團萃取蛋白質(zhì)的機理目前尚不十分清楚。一般認為，萃取過程是靜電力、疏水力、空間力、親和力或幾種力協(xié)同作用的結(jié)果，其中蛋白質(zhì)與表面活性劑極性頭間的靜電相互作用是主要推動力。根據(jù)所用表面活性劑類型，通過控制水相pH高于或低于蛋白質(zhì)的等電點（pI），達到正萃反萃的目的。
2.2 反膠束萃取蛋白質(zhì)的應用
2.2.1 同時提取蛋白質(zhì)和油脂：陳復生等在AO-異辛烷反膠束同時萃取花生蛋白和花生油的過程，采用正交試驗分析討論了影響萃取的主要因素得到了*萃取工業(yè)條件。萃取后，油進入有機相而蛋白質(zhì)溶入反膠束中。克服了傳統(tǒng)方法工藝復雜，得率低，蛋白質(zhì)容易變性的缺點。同時用蒸餾方法將油和烴分開，提煉出了油脂。
2.2.2 分離蛋白質(zhì)混合物：Chang在Aliquat336/異辛烷反膠束分離枯草桿菌中兩種酶——淀粉酶和中性蛋白酶時，通過加入助表面活性劑丁醇，有效地分離了這兩種不同等電點的酶。
2.2.3 從發(fā)酵液中分離和提純酶：Krishnakant用AOT/異辛烷體系從土豆發(fā)酵液中提取酸性磷酸酶，在pH值810，萃取水相與有機相體積比為3：1，反萃水相與有機相體積比為1：1時得到zui大活性的酸性磷酸酶。Sun在CB-卵磷脂親和反膠束中加入Tween85，直接從雞蛋清中提取了溶菌酶。而該反膠束系統(tǒng)還可以回收后反復使用。
三、雙水相萃取
3.1 雙水相萃取的原理及特點
3.1.1 雙水相萃取的原理
雙水相萃取與水-有機相萃取的原理相似，都是依據(jù)物質(zhì)在兩相間的選擇性分配，但萃取體系的性質(zhì)不同。當物質(zhì)進入雙水相體系后，由于表面性質(zhì)、電荷作用和各種力（如憎水鍵、氫鍵和離子鍵等）的存在和環(huán)境因素的影響，使其在上、下相中的濃度不同。分配系數(shù)K等于物質(zhì)在兩相的濃度比，由于各種物質(zhì)的K值不同，可利用雙水相萃取體系對物質(zhì)進行分離。
3.1.2 雙水相萃取的特點
雙水相體系萃取具有如下特點：（1）含水量高（70%~90%），是在接近生理環(huán)境的溫度和體系中進行萃取，不會引起生物活性物質(zhì)失活或變性；（2）分相時間短，自然分相時間一般為5~15min；（3）界面張力小（10-7~10-4mN/m），有助于強化相際間的質(zhì)量傳遞；（4）不存在有機溶劑殘留問題；（5）大量雜質(zhì)能與所有固體物質(zhì)一同除去，使分離過程更經(jīng)濟；（6）易于工程放大和連續(xù)操作。由于雙水相萃取具有上述優(yōu)點，因此，被廣泛用于生物化學、細胞生物學和生物化工等領(lǐng)域的產(chǎn)品分離和提取。
3.2 雙水相萃取在分離和提取各種蛋白質(zhì)（酶）上的應用
用聚乙二醇（PEG）/羥丙基淀粉酶（Reppal PEG）體系經(jīng)兩步法可從黃豆中分離磷酸甘油酸激酶（PGK）和磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）。在黃豆勻漿中加入PEG4000，可絮凝細胞碎片及大部分雜蛋白。在上清液中加入PEG4000（12%）-ReppalPES（40%），PGK在上相、GAPGH在下相的收率均在80%以上。萃取過程的放大采用離心傾析機連續(xù)處理勻漿液，用離心萃取器完成雙水相體系的兩相分離，整個工藝具有處理量大、接觸時間短、酶收率高的特點。用PEG/（NH4）2SO4雙水相體系，經(jīng)一次萃取從A-淀粉酶發(fā)酵液中分離提取α-淀粉酶和蛋白酶，萃取zui適宜條件為PEG1000（15%）-（NH4）2SO4（20%），pH=8，α-淀粉酶收率為90%，分配系數(shù)為19.6，蛋白酶的分離系數(shù)高達15.1。比活率為原發(fā)酵液的1.5倍，蛋白酶在水相中的收率高于60%。通過向萃取相（上相）中加進適當濃度的（NH4）2SO4可達到反萃取。實驗結(jié)果表明，隨著（NH4）2SO4濃度的增加，雙水相體系兩相間固體物析出量也增加。固體沉淀物既可干燥后生產(chǎn)工業(yè)級酶制劑，也可將固體物加水溶解后用有機溶劑沉淀法食品級酶制劑.
Harris用雙水相體系從羊奶中純化蛋白，研究了牛血清清蛋白（OSA）、牛酪蛋白、β-乳球蛋白在PEG/磷酸鹽體系中的分配以及PEG相對分子質(zhì)量、pH值和鹽的加入對3種蛋白分配的影響。實驗結(jié)果表明。增加NaCl濃度，可提高分配系數(shù)，*pH為5。對OSA和牛酪蛋白，可得到更高的分配系數(shù)。在含有疏水基葡聚糖中，蛋白質(zhì)和類囊體薄膜泡囊的分配研究表明，苯甲酰基葡聚糖和戊酰基葡聚糖具有疏水性。疏水基影響氨基酸、蛋白質(zhì)和薄膜泡囊在雙水相體系中的分配，在只有磷酸鹽緩沖溶液的PEG8000/葡聚糖雙水相體系中，大部分β-半乳糖苷酶被分配在上相，但在下相中加入少量的苯甲酰基葡聚糖（取代程度為0.054）或戊酰基葡聚糖（取代程度為0.12）時，β-半乳糖苷酶的分配系數(shù)就降低了100倍。在對牛血清清蛋白、溶菌酶、脂肪酶和β-乳球蛋白的分配進行的觀察中發(fā)現(xiàn)具有相似的現(xiàn)象。類囊體薄膜泡囊的分配受疏水基的影響特別大，薄膜泡囊被分配在含有疏水基的一相中。在含有N，N-二甲基甲酰胺的聚合物雙水相中，利用逆流分配可對玉米醇溶蛋白進行分級分離。Miyuki在PEG/K3PO4雙水相體系中用兩步法對葡糖淀粉酶進行了萃取純化。用*步萃取后含有酶的下相和PEG組成雙水相作為第二步萃取體系，稱作兩步法。葡糖淀粉酶的*分配條件是PEG4000（*步）、PEG1500（第二步），pH=7，純化系數(shù)提高了3倍。
四、電泳
4.1 電泳的定義原理及優(yōu)點
在電場作用下，帶電顆粒在溶液中的運動稱為電泳，在小離子的情況下，稱為離子導電性現(xiàn)象。這是一種不*的電解現(xiàn)象，所需的產(chǎn)物不是直接釋放在電極上，而是使它們不同的運動同步受阻在兩電極間的中間位置上。它能分離非常類似的物質(zhì)，包括不同的蛋白質(zhì)，提高了分折和制備的效果，特別是在紙上和在聚丙烯酰胺或瓊脂糖凝膠上區(qū)帶電泳的采用。
電泳是分離生化物質(zhì)的一種有效的和多功能的方法。在電場的作用下，電泳流動性的差別，可用于許多物質(zhì)的分離，其中包括離子、膠體、細胞物質(zhì)、細胞器以及全細胞。以前電泳僅用于常規(guī)的生化分析，但近期在制備電泳上取得了許多重大的進展（如低容積高價值的化合物或試劑的生產(chǎn)中）。
電泳分離的優(yōu)點是分辨率高和能保持產(chǎn)物的生物活性。
4.2 毛細管電泳（CE）
毛細管電泳是一類以毛細管為分離通道，以高壓直流電場為驅(qū)動力的新型液相分離技術(shù)。毛細管電泳具有多種分離模式：毛細管區(qū)帶電泳（CZE）、毛細管等速電泳（CITP）、毛細管等電聚焦（CIEF）等。應用毛細管電泳分離多肽類物質(zhì)具有柱效高、分析時間短、所用樣品量和試劑少等優(yōu)點。黃志東等使用MECC在8min分離了7種肽類物質(zhì)。
與液相色譜相比，CE的制備總量低，只適用于微量制備；對擴散系數(shù)小的生物大分子而言，CE比HPLC的分辨率高得多，因此CE被用來作為收集非常純的單一餾分的微量制備手段。
4.3 二維凝膠電泳技術(shù)（two－dimensional del electrophoresis，2-DE）
2-DE是1975年由O’Farrell建立的，其基本原理是根據(jù)蛋白質(zhì)具有不同等電點和相對分子質(zhì)量的二個一級特性，將蛋白質(zhì)的混合物在等電聚焦電泳（isoelectric focusing，IEF）中進行*維的分離，然后轉(zhuǎn)入十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）進行第二維分離，分離膠經(jīng)顯色后，通過商業(yè)化的計算機軟件對凝膠圖像進行分析處理。
經(jīng)典的22DE采用載體兩性電解質(zhì)（carrier ampholyte CA）進行等電聚焦，這種方法重復性差、pH梯度不穩(wěn)定，因此，限制了2－DE的廣泛應用。1988年，固相化pH梯度膠條（immobilized PH gradients， IPGs）技術(shù)的建立，克服了CA的缺點。IPGs技術(shù)的應用為各實驗室間的交流、蛋白質(zhì)圖譜及蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫的建立奠定了基礎。
生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)除數(shù)量多之外，還具有不同的豐度、相對分子質(zhì)量、酸堿度以及可溶性、疏水性的不同，因此2－DE的一次分離不能*呈現(xiàn)所有的蛋白質(zhì)，尤其對于組織和細胞內(nèi)低豐度蛋白質(zhì)、極酸和極堿性區(qū)蛋白質(zhì)、高分子質(zhì)量區(qū)蛋白以及膜蛋白等。針對以上缺點，研究者對2－DE進行了許多改進，如采用窄范圍的pH膠條（2～3pH單位和1pH單位）、預分離技術(shù)、預分離技術(shù)與窄范圍pH膠條的聯(lián)合應用等。這些技術(shù)的應用改善了2－DE的分辨率，提高了低豐度蛋白質(zhì)和膜蛋白的檢出率。
二維差異凝膠電泳（two2－dimensional difference gel electrophoresis，2D-DIGE）是二維電泳技術(shù)的另一個突破.該技術(shù)應用兩種不同的熒光染料Cy3和Cy5，分別標記不同的蛋白質(zhì)樣品，然后將兩種樣品等量混合，在同一2-DE中分離.通過在同一塊膠上對比一個蛋白點處兩種不同熒光的強度，比較兩種狀態(tài)下特定蛋白質(zhì)豐度變化、蛋白質(zhì)的缺失或是否有新蛋白質(zhì)的出現(xiàn)等。DIGE克服了二維電泳過程中不同凝膠間重復性差的問題；同時可以在同一塊膠上更直觀地觀察兩種樣品蛋白質(zhì)的差異表達并對其定量。
五、結(jié)論
隨著生物分離技術(shù)的發(fā)展、新的生物分離技術(shù)的不斷出現(xiàn)，為蛋白質(zhì)的分離提供了許多新的方法和途徑。但其中仍然有許多問題，如成本過高，分離量少，難以實現(xiàn)工業(yè)化等。還需要我們不懈努力改進。
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